Проточная цитометрия: преимущества метода и область применения

Содержание

Проточная цитометрия

Проточная цитометрия: преимущества метода и область применения

  • 1 Проточная цитометрия
    • 1.1 Образцы для проточной цитометрии
    • 1.2 Принцип метода
    • 1.3 Наиболее часто используемые флуорохромы
    • 1.4 Преимущества метода
    • 1.5 Область применения
      • 1.5.1 Иммунология
      • 1.5.2 Онкология
      • 1.5.3 Цитология
      • 1.5.4 Гематология
      • 1.5.5 Фармакология
  • Литература

1. Проточная цитометрия

Проточная цитометрия является современной технологией быстрого оптического измерения параметров клетки, ее органелл и происходящих в ней процессов.

Методика заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча при прохождении через него клетки в струе жидкости, причём, степень световой дисперсии позволяет получить представление о размерах и структуре клетки. Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.

1.1. Образцы для проточной цитометрии

  • кровь
  • костный мозг
  • ликвор
  • суставная жидкость
  • плевральная жидкость
  • асцитическая жидкость
  • суспензированные клетки тканей (например, опухолей)

1.2. Принцип метода

Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями, попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку. Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом за счет т. н. гидродинамического фокусирования струи в струе. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:

  • рассеяние света под малыми углами (от 1° до 10°) (данная характеристика используется для определения размеров клеток).
  • рассеяние света под углом 90° (позволяет судить о соотношении ядро/цитоплазма, а также о неоднородности и гранулярности клеток).
  • интенсивность флуоресценции по нескольким каналам флуоресцентности (от 2 до 18-20)- позволяет определить субпопуляционный состав клеточной суспензии и др.

1.3. Наиболее часто используемые флуорохромы

  • Флуоресцеина изотиоцианат (FITC)
  • Фикоэритрин (PE, RD1)
  • Перидинин-Хлорофилл Протеин (Per-CP)
  • Алофикоцианин (APC)

Тандемные красители:

  • Фикоэритрин — Техасский красный (ECD)
  • Фикоэритрин — Cy5 (PC5)
  • Фикоэритрин — Cy7 (PC7)
  • Аллофикоцианин- Cy7 (APC-Cy7)

“Квантовые точки” QD560, QD590 и т.д.

1.4. Преимущества метода

  • короткое время анализа (сек) за счет высокой скорости
  • анализ большого количества клеток (до 108 клеток)
  • логические ограничения допускают детектирование субпопуляций клеток
  • измерение параметров редко встречающихся клеток
  • объективное измерение интенсивности флуоресценции

1.5.1. Иммунология

  • иммунофенотипирование клеток периферической крови
  • определение фагоцитарной активности (захват меченных флюорохромами бактерий или дрожжей)
  • определение внутриклеточных цитокинов (спонтанная продукция и под действием различных специфических или неспецифических активаторов, таких как ФМА + иономицин, ЛПС, ФНО-альфа)
  • определение внутриклеточных белков, например транскрипционных факторов GATA-3, T-bet, FoxP3 для дискриминации CD4 Т-лимфоцитов
  • определение пролиферативной активности (выявление инкорпорированого бромдезоксиуридина)
  • исследование клеточного цикла
  • оценка клеточной цитотоксичности

1.5.2. Онкология

  • количественный анализ внутриклеточных компонентов (ДНК)
  • анализ стадий клеточного цикла
  • выявление анеуплоидного клона
  • определение пролиферативной активности анеуплоидного клона
  • определение специфических маркеров
  • позволяет проводить наблюдение пациентов, входящих в группу риска
  • оценка состояния иммунной системы:
  • оценка клеточного звена иммунитета (определение субпопуляций лимфоцитов)
  • оценка функциональной состоятельности иммунокомпетентных клеток (NK тест, фагоцитарный тест и т.п.)

1.5.3. Цитология

  • определение цитоморфологической принадлежности клетки размер, соотношение ядро/цитоплазма, степень асимметричности и гранулярности клеток
  • оценка активности внутриклеточных ферментов с помощью флуорогенных субстратов
  • определение экспрессии поверхностных антигенов
  • анализ стадий клеточного цикла
  • измерение физиологических параметров клетки (внутриклеточный pH, концентрация свободных ионов Ca2+, потенциал наружной клеточной мембраны)

1.5.4. Гематология

  • анализ субпопуляционного состава клеток периферической крови
  • подсчет ретикулоцитов, анализ тромбоцитов по специфическим маркерам
  • дифференциальная диагностика лимфопролиферативных заболеваний и реактивных лимфоцитозов
  • диагностика лимфопролиферативных заболеваний
  • диагностика острых лейкозов
  • оценка минимальной резидуальной болезни

1.5.5. Фармакология

  • измерение экспрессии маркеров
  • измерение активности внутриклеточных ферментов
  • определений стадий клеточного цикла в рамках изучения механизмов воздействия различных биологически активных веществ на клеточном уровне

В настоящее время проточная цитометрия применяется для выявления определённых клеток в исследуемых образцах (как бактериальных и грибковых, так и собственных клеток организма человека), определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, а также мониторирования состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Выявление бактериальных, грибковых, а также собственных клеток организма в биологических жидкостях крайне важно для диагностики многих заболеваний.

В ходе одного из исследований было показано, что проточная цитометрия обладает в 100—1000 раз более высокой чувствительностью по сравнению с микроскопией и позволяет выявлять бактериальные клетки в количестве 10-100 в 1 мл крови.

При более низкой концентрации бактерий в образце возможно проведение предварительной инкубации. Высокую чувствительность методу придает использование моноклональных антител, помеченных флуоресцирующим веществом.

Проточная цитометрия позволяет не только выявлять инфицирование микроорганизмами, но и определять спектр их чувствительности, причём, длительность исследования не превышает нескольких часов.

Подвергнутые воздействию антибиотиков (in vivo или in vitro) микроорганизмы сравнивают с контрольными образцами того же штамма для установления их жизнеспособности, а также изменений в нуклеиновых кислотах, белках, оболочке клеток и т. п.

, что позволяет оценить как степень эффекта антибиотика, так и точку приложения его действия.

Ещё одной областью применения проточной цитометрии является мониторирование состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных лиц путём определения абсолютного количества CD4+ клеток и их доли в популяции лимфоцитов (отношение CD4+/CD8+). Методика может также использоваться для контроля эффективности проводимой терапии.

скачать
Данный реферат составлен на основе статьи из русской Википедии. Синхронизация выполнена 12.07.11 02:17:07
Категории: Методы биологических исследований.
Текст доступен по лицензии Creative Commons Attribution-ShareA.

Источник: http://wreferat.baza-referat.ru/%D0%9F%D1%80%D0%BE%D1%82%D0%BE%D1%87%D0%BD%D0%B0%D1%8F_%D1%86%D0%B8%D1%82%D0%BE%D0%BC%D0%B5%D1%82%D1%80%D0%B8%D1%8F

Принцип метода проточной цитометрии в клинической лабораторной диагностике

Проточная цитометрия: преимущества метода и область применения

Количественная цитометрия – относительно новая методика микробиологического исследования дисперсионных сред, проводимая с помощью специального оборудования. Цитометрия бывает статической и проточной.

Статическая цитометрия проводится с использованием конфокальных микроскопов; при их отсутствии в ход идут слегка модифицированные люминесцентные микроскопы, оснащенные простыми и дешевыми системами анализа изображений.

Проточная цитометрия осуществляется на специальных аппаратах – сортерах и проточных цитрометрах.

Оба варианта количественной цитометрии имеют широчайшие возможности применения в практике медицинских и биологических исследований. Несмотря на разность используемого клинического материала и экспериментальных моделей решаемые ими задачи подчиняются общим принципам исследования.

Что такое проточная цитометрия?

Проточной цитометрией называют методику исследования дисперсионных субстанций в режиме поштучного анализа частиц, входящих в состав дисперсной фазы по сигналам, получаемым в ходе флуоресценции и рассеивания света.

Название методики точно отражает сущность обозначаемого процесса, состоящего в исследовании потока одиноких биологических частиц.

Методика проточной цитометрии была создана на базе специальных экспериментов по определению размера исследуемых частиц и подсчету их количества.

Первый клеточный сортер был создан в 1965 году, а с начала следующего десятилетия был налажен выпуск приборов, предназначенных для измерения интенсивности флуоресценции при нескольких длинах волн с целью определения сразу нескольких параметров изучаемых клеток.

Современные исследователи для осуществления проточной цитометрии используют приборы двух типов:

  • Приборы, предназначенные для измерения флуоресценции при двух (и более) длинах волн и рассеивании света под углом в десять (так называемом малоугловом прямом рассеивании) и девяносто градусов. Приборы этого типа отличаются простотой использования.
  • Довольно громоздкие клеточные сортеры, способные измерить более пяти параметров исследуемых ядер или частиц, а также отсортировать клетки, обладающие определенным набором параметров.

Устройство современных проточных цитометров настолько сложно и разнообразно, что с трудом поддается какому-либо обобщению и систематизации, однако несколько общих моментов, характерных для всех приборов, все же существует:

  • Для проведения анализа на цитометре любого типа требуется гомогенная суспензия клеток определенного типа.
  • Не должно быть недостатка в количестве исследуемых клеток или их ядер.
  • Чтобы не допустить слипания клеток, исследователь должен обладать всей полнотой информации о характере рассеивания света и иметь под рукой таблицы с соответствующими данными.

Образцы

В ходе медицинских и биологических исследований изучаются образцы, приготовленные из клеток:

  • костного мозга;
  • крови;
  • спинномозговой жидкости (ликвора);
  • синовиальной (суставной) жидкости;
  • плевральной жидкости;
  • перитонеальной (асцитической) жидкости, накапливающейся в брюшной полости в процессе развития асцита;
  • опухолевых и здоровых тканей.

Принцип метода проточной цитометрии

Принципы, заложенные в основу процедуры цитометрии, чрезвычайно просты.

Суспензия, приготовленная из клеток, предварительно помеченных флуоресцирующими моноклональными антителами или флуорохромами, помещается в поток дисперсионной среды, пропускаемый через проточную ячейку.

Гидродинамическое фокусирование струи клеточной суспензии в струе дисперсионной среды приводит к тому, что исследуемые клетки или их ядра выстраиваются поодиночке и в таком порядке пересекают пучок сфокусированных световых (обычно лазерных) лучей.

Под воздействием определенных световых волн происходит одновременное возбуждение молекул разных флуоресцирующих красителей, что делает возможным анализ сразу нескольких параметров клеточных структур.

[attention type=red]
Свет, исходящий от флуорохромов, фокусируют при помощи оптической системы, состоящей из нескольких зеркал и линз, а затем раскладывают на определенные компоненты.
[/attention]

Полученные световые сигналы подвергают анализу и преобразованию в электрические импульсы, а затем – в определенные формы, приемлемые для компьютерной обработки и хранения полученной информации.

Флуорохромы

Для того чтобы облегчить процесс определения клеточных структур в ходе процедуры проточной цитометрии, используемую дисперсионную среду подкрашивают специальными флуоресцирующими красителями – флуорохромами.

После такой обработки исследуемые клетки приобретают способность флуоресцировать (светиться) под воздействием пучка световых лучей.

При выборе того или иного красителя пользуются целым рядом критериев:

  • Используемый флуорохром должен быть специфичным по отношению к исследуемой ДНК.
  • Спектральные характеристики красителя должны соответствовать возможностям используемой аппаратуры.
  • Немаловажным фактором является стоимость флуорохрома (она не должна быть очень высокой).
  • Используемые красители должны быть удобны в работе (обладать стабильностью и хорошей растворимостью).

Одним из самых востребованных флуорохромов является йодистый пропидий: его спектральные характеристики идеально подходят для выполнения проточной цитометрии.

Чтобы активизировать флуоресценцию, используя йодистый пропидий, исследователи прибегают к помощи обычного аргонового лазера (рабочая длина его волны составляет 480 нм). Площадь флуоресцирующего участка такова, что позволяет использовать вышеозначенный флуорохром для выполнения многопараметрических измерений.

Для проведения проточной цитометрии также используют:

  • изотиоцианат флуоресцеина;
  • фикоэритрины (Су5, Су7, техасский красный);
  • аллофикоцианин;
  • Перидинин-Хлорофилл Протеин.

В качестве флуорохромов могут использоваться также флуоресцирующие моноклональные антитела.

Вне зависимости от того, какой именно краситель принимает участие в процедуре, его количество должно быть прямо пропорционально содержанию ДНК в структуре клетки.

Чтобы добиться качественного прокрашивания всех клеточных структур, количество применяемого флуорохрома должно быть избыточным.

Большинство флуорохромов, вступающих в контакт с ДНК, не способно пройти сквозь мембраны неповрежденных (интактных) клеток. Для повышения проницаемости клеточных мембран исследуемые клетки обрабатывают поверхностно-активными веществами (детергентами) или спиртом.

Преимущества

Несомненными преимуществами проточной цитометрии можно считать:

  • Высокую (до ста тысяч эпизодов в секунду) скорость выполнения анализа.
  • Возможность определения клеточных субпопуляций.
  • Способность выполнить анализ огромного (до 108 элементов в одном мл дисперсионной среды) количества клеток.
  • Возможность определения параметров любых клеток и клеточных структур (в том числе и редко встречающихся).
  • Высокую степень объективности в измерении интенсивности свечения (флуоресценции).

Где применяется?

Спектр применения проточной цитометрии необыкновенно широк. Она применяется даже в индустрии, для контроля производственного процесса. Продемонстрируем это, для наглядности представив информацию в виде списков.

В онкологии

В этом разделе медицины проточную цитометрию применяют с целью:

  • количественного анализа внутриклеточных структур (ДНК);
  • исследования основных параметров клеточного цикла;
  • идентификации и подсчета клеток, относящихся к разным периодам клеточного цикла;
  • обнаружения анеуплоидных клонов (аномальных клеток с нестандартным набором хромосом), свидетельствующих о развитии острого лейкоза;
  • выявления степени пролиферативной активности (тенденции к активному делению) анеуплоидных клонов;
  • обнаружения опухолевых маркеров;
  • наблюдения за состоянием пациентов, находящихся в группе риска;
  • оценки функционирования иммунной системы и функциональной состоятельности иммунных клеток;
  • выявления субпопуляций лимфоцитов (эта характеристика позволяет оценить состояние иммунитета).

о методе проточной цитометрии в диагностике острых лейкозов:

Иммунологии

Метод проточной цитометрии позволяет:

  • осуществить иммунофенотипирование (определить тип и функциональное состояние) клеток крови;
  • установить фагоцитарную активность иммунных клеток (об этом свидетельствует захват бактерий, помеченных флуоресцирующими красителями);
  • идентифицировать внутриклеточные белки;
  • определить степень пролиферативной активности;
  • исследовать стадии клеточного цикла;
  • оценить степень цитотоксичности (защитного механизма, позволяющего на внутриклеточном уровне уничтожать простейшие организмы, бактерии и вирусы) клеток.

Цитологии

Проточная цитометрия дает исчерпывающие данные, позволяющие:

  • безошибочно установить цитоморфологические характеристики любой клетки (ее размеры, уровень асимметричности, соотношение между ядром и цитоплазмой);
  • оценить активность ферментов, входящих в состав клетки;
  • проанализировать стадии клеточного цикла;
  • измерить физиологические внутриклеточные параметры (уровень pH, потенциал клеточной мембраны, концентрацию свободных ионов).

Гематологии

С помощью проточной цитометрии гематологи могут:

  • проанализировать субпопуляционный состав кровяных клеток;
  • подсчитать количество ретикулоцитов и тромбоцитов с помощью специфических маркеров;
  • оценить последствия резидуальной (остаточной, не до конца излеченной) болезни;
  • диагностировать острый лейкоз;
  • выполнить дифференциальную диагностику реактивного лимфоцитоза и лимфопролиферативных болезней (недугов, при которых поражаются клетки, имеющие лимфоидную природу);
  • осуществить диагностику заболеваний лимфопролиферативной этиологии.

Фармакологии

Проточная цитометрия помогает фармакологам:

  • установить уровень экспрессии (чувствительности опухолей разных локализаций к лечению лекарственными препаратами) белковых маркеров;
  • измерить активность ферментов, входящих в состав клеток;
  • занимающимся изучением действия биоактивных веществ на состояние клеток человеческого организма, определить любую стадию клеточного цикла.

Сельском хозяйстве

Метод проточной цитометрии активно используется учеными, специализирующимися на селекции новых видов растений и выведении пород домашнего скота, поскольку она позволяет:

  • определить плоидность (количество одинаковых хромосомных наборов в ядрах) клеток;
  • произвести анализ любой стадии клеточного цикла;
  • выполнить анализ содержимого протопластов (бактериальных или растительных клеток), а также произвести их сортировку в соответствии с заданными параметрами.

Источник: http://gidmed.com/onkologiya/diagnostika-onk/protochnaya-tsitometriya.html

Проточная цитофлуориметрия – сущность и применение

Проточная цитометрия: преимущества метода и область применения

Проточная цитофлуориметрия – это цитологический метод исследований, применяющийся для углубленного анализа клеток. Его преимуществом является то, что он позволяет изучить каждую клетку в отдельности.

Данный вид анализа помогает произвести оценку нескольких параметров у сотен клеток за считанные секунды.

Благодаря этому цитофлуориметрия считается одним из наиболее быстрых и точных способов анализа, которые доступны ученым и клиницистам в настоящее время.

Принцип

Принцип метода проточной цитофлуориметрии основан на измерении рассеивания света и свечения (флуоресценции) клеток. Клеточную суспензию пропускают в виде потока с большой скоростью через ячейку цитометра, где происходит ее облучение лазером.

Там же производится, так называемая гидродинамическая фокусировка. Ее механизм заключается в том, что поток из ячейки с изучаемыми частицами на выходе вливается во внешнюю струю, которая обладает большей скоростью.

В результате происходит выстраивание частиц в упорядоченную цепочку.

Предварительно клетки метят специальными флуоресцирующими красителями (флуорохромами). Благодаря им лазерный луч возбуждает вторичное свечение. Полученные световые сигналы регистрируются детекторами. В последующем информация обрабатывается при помощи программных алгоритмов, которые позволяют подсчитать отдельные популяции клеток, различающиеся по каким-либо критериям.

Исследование с помощью традиционной микроскопии часто не позволяет отличить разные клетки, так как они одинаково выглядят. Цитофлуориметрия может предоставить и другие данные (целостность структуры ДНК), провести анализ экспрессии белков, выживаемости клеток.

Так как для возбуждения флуорохромов нужны световые лучи с разной длиной волны, а также разные типы детекторов, то современные установки оснащены несколькими каналами детекции (от 4 до 30). Количество лазерных излучателей может быть от 1 до 7. Более сложные по составу устройства позволяют осуществлять многопараметрические исследования сразу нескольких свойств частиц.

Преимущества и недостатки

К преимуществам проточной цитофлуориметрии относятся следующие:

  • высокая скорость обработки (регистрация до 30 тысяч событий за 1 секунду);
  • возможность исследования большого числа клеток (до 100 млн. в образце);
  • количественная оценка интенсивности флуоресцентного излучения;
  • анализ каждой из клеток;
  • одновременное исследование разнородных процессов;
  • автоматическое разделение данных по популяциям клеток;
  • качественная визуализация результатов.

Еще одной особенностью этой технологии является то, что анализируемую частицу допускается окрашивать несколькими флуоресцентными растворами. Благодаря этому происходит многопараметрическое исследование.

К недостаткам можно отнести сложность технического оборудования и необходимость специальной подготовки пробы.

Первые устройства такого типа появились уже в 1968 году в Германии, но широкое распространение они получили гораздо позднее. В настоящее время все приборы, работающие по методу проточной цитофлуориметрии, можно разделить на 2 типа:

  • устройства, что измеряют флуоресцентное излучение (две и более длины волны), рассеяние света под углом 10 и 90° (детектор малоуглового и бокового рассеяния);
  • аппараты, которые, помимо измерения нескольких клеточных параметров, автоматически производят сортировку на группы в соответствии с этими критериями.

Детектор прямого светорассеяния предназначен для определения размеров клетки, а устройство для регистрации бокового светорассеяния позволяет получить информацию о наличии внутриклеточных гранул, объемного соотношения цитоплазмы и ядра.

Классические цитометры, в отличие от световых микроскопов, не позволяют получить изображение клетки. Однако в последние годы разработаны комбинированные устройства, которые способны совмещать возможности микроскопа и цитофлуориметра. Речь о них пойдет ниже.

Визуализирующие цитометры

Для приборов, использующихся в классической проточной цитофлуориметрии, характерна одна особенность: если в популяции анализируемых клеток зарегистрированы редкие события, то нет возможности оценить, какова их суть.

Эти частицы могут оказаться как останками умерших клеток, так и их редкой группой.

В обычных аппаратах такие данные исключаются из общего потока событий, однако именно они могут представлять особую ценность для научного и клинического анализа.

Визуализирующие проточные цитометры нового поколения позволяют зафиксировать изображение каждой клетки, проходящей в потоке через зону детектора. Его легко увидеть, нажав на соответствующую область диаграммы, которая выводится на монитор компьютера.

Сферы применения

Проточная цитофлуориметрия – универсальный метод, который применяется во многих областях медицины и науки:

  • иммунология;
  • онкология;
  • трансплантология (трансплантация красного костного мозга, стволовых клеток);
  • гематология;
  • токсикология;
  • биохимия (измерение кислотности внутри клетки, исследование других параметров);
  • фармакология (создание новых лекарств);
  • микробиология;
  • паразитология и вирусология;
  • океанология (изучение фитопланктона для оценки состояния водоемов и другие задачи);
  • нанотехнологии и анализ микрочастиц.

Иммунология

Иммунная система человека состоит из большого количества разнообразных клеток. Проточная цитофлуориметрия в иммунологии позволяет оценить их структуру и функции, то есть провести морфофункциональный анализ.

Такие исследования помогают изучить сложную природу иммунитета. Фенотипы клеток меняются в результате активации антигенами, развития патологий и других факторов. Цитофлуориметрия может разделить субпопуляции иммунных клеток в сложной смеси и оценить все их изменения в динамике.

Онкология

Одной из важнейших задач в онкологии является дифференцирование клеток по их типу.

Принцип анализа по методу проточной цитофлуориметрии в онкогематологии основан на следующем явлении: при обработке пробы специальным флуоресцентным красителем происходит его связывание с белками цитоплазмы.

После деления в активно пролиферирующих клетках происходит снижение его содержания в два раза. Соответственно, двукратно уменьшается и интенсивность свечения клеток.

Существуют и другие способы выявления пролиферирующих клеток:

  • использование ДНК-связывающих красителей (йодид пропидия);
  • применение меченого урацила;
  • регистрирование повышенного уровня экспресии белков циклинов, которые участвуют в регуляции клеточного цикла.

Источник: https://FB.ru/article/464918/protochnaya-tsitofluorimetriya---suschnost-i-primenenie

Диагностика аллергий методом проточной цитометрии

Проточная цитометрия: преимущества метода и область применения

Диагностика аллергии осуществляется комплексно и преимущественно основывается на описании клинической картины заболевания, а также собранном аллергологическом анамнезе и лабораторных исследованиях

Диагностика аллергии осуществляется комплексно и преимущественно основывается на описании клинической картины заболевания, а также собранном аллергологическом анамнезе и лабораторных исследованиях.

Лабораторная диагностика аллергии

Лабораторная аллергодиагностика применяется в следующих случаях:

Больше статей в журнале «Справочник заведующего клинико-диагностической лабораторией» Активировать доступ

  • в анамнестически сложных случаях;
  • при неоднозначных или сомнительных результатах кожных проб;
  • при имеющихся противопоказаниях к применению кожных проб.

Данный вид диагностики связан с рядом трудностей, которые обусловлены многообразием патогенетических механизмов аллергической реакции.

Большая часть применяемых лабораторных методов позволяет диагностировать заболевания, проявляемые реакциями гиперчувствительности немедленного тип, или реакциями первого типа. Это имеет особое клиническое значение, поскольку эти заболевания протекают особо тяжело.

Реакции аллергии первого типа обусловлены IgR-опосредованным выделением медиаторов из тучных клеток и сенсибилизированных базофилов при контакте с возбудителем (аллергеном) и часто наблюдаются при крапивнице, аллергическом рините, бронхиальной астме и др.

Преимущества и недостатки лабораторной диагностики

Преимущества:

  • объективность результатов исследования;
  • возможность выявления сенсибилизации к значительному числу аллергенов;
  • отсутствие противопоказаний для обследования;
  • отсутствие необходимости для отмены приема антигистаминных препаратов;
  • отсутствие патологических реакций во время обследования.

Недостатки:

  • вероятность получения ложных (отрицательных) результатов в период ремиссии, а также из-за наличия латентной сенсибилизации;
  • высокая стоимость обследования;
  • длительное время получения результата теста.
  • В статье вы найдете только несколько готовых образцов и шаблонов. В Системе «Консилиум» их более 5000.

Успеете скачать всё, что нужно, по демодоступу за 3 дня?

Активировать

Тест активации базофилов

Одним из самых перспективных и функциональных клеточных тестов в последнее время признается тест активации базофилов. В его основе определение качества активированных  базофилов после их стимуляции различными аллергенами in vivo (пищевые, инсектные, ингаллякционные и др.). Данный метод позволяет моделировать ситуацию контакта аллергена с базофилами периферической крови пациента.

Основные области применения теста:

  • выявление разных видов аллергенов для подтверждения и диагностики IgE-зависимой аллергии или псевдоаллергии., в случае, если проведение кожных тестов и анализа противоречивых IgE является невозможным;
  • оценка эффективности препаратов против IgE, а также аллерген-специфической иммунотерапии;
  • оценка возможности повторного введения продукта после окончания элиминационной терапии.

Диагностика аллергии методом проточной цитометрии

На сегодняшний день различные производители предлагают наборы для выявления аллергии методом проточной цитометрии (активация базофилов). В таблице ниже представлена характеристика таких тестов.

Клетки/маркерыFlow-CASTBASOTESTAllergenicity kit
Выделение лейкоцитовРекомендованоНе требуетсяНе требуется
Маркеры для идентификации базофиловРецептор для IgE (FcεRI)Рецептор для IgE (FcεRI)CD3-CRTH2 CD203c
Маркер для выявления активации базофиловCD63CD63CD203c
Типы клеток, на которых представлены маркеры активацииБазофилы, тучные клетки, тромбоциты, макрофагиБазофилы

У метода проточной цитометрии существует ряд преимуществ:

  • для исследования необходимо небольшое количество образца крови  (50-100 мкл);
  • исследование маркеров активации происходит на уровне одной клетки;
  • получение результата анализа в краткие сроки (1-2 часа);
  • идентификация базофилов происходит без их выделения из цельной крови.

Алгоритм проведения теста

В ходе теста происходит:

  • исследование спонтанной активации базофилов при негативном контроле (с буферным раствором);
  • исследование индуцированной активации базофилом при позитивном контроле (стимулирование IgE-антителами);
  • исследование индуцированной реакции базофилов при их стимуляции разными аллергенами (тестовая проба).

При активации базофилов необходимо соблюдать целый ряд условий.

Инкубация крови с потенциальными аллергенами для идентификации и оценки активации базофилов проводится при средней температуре в 37°С в полной темноте при наличии ионов кальция в течение 15 минут.

После лейкоциты фиксируют реагентами, которые входят в набор. Далее, после отмывки буфером и ресуспендирования пробы готовы для дальнейшего исследования методом проточной цитометрии. Данный метод предполагает оценку 500 базофилов.

Для корректного оценивания активации базофилов необходимо знать особенности используемого в наборе маркера активации:

  • при использовании маркера CD63 базальный уровень активации базофилов в большинстве случаев ниже 2%;
  • при использовании маркера CD203 уровень активации базофилов часто значительно выше в случае массового поступления аллергена, к примеру, при обострении астмы, в разгар цветения и т.д.

Противоаллергенные препараты не влияют на оценку результатов теста, однако, например, прием стероидов может снизить чувствительность этого метода.

Правила оценки позитивности теста

На сегодняшний день единых правил оценки позитивности теста активации базофилов, не установлено.

Существует два основных подхода к изучению активации  базофилов: оценка реактивности базофилов по изменению их количества по сравнению с начальным уровнем и оценка чувствительности базофилов исходя из концентрации аллергена, при которой большая часть всех исследованных базофилов становится активированной.

Второй подход является наиболее востребованным при оценке эффективности аллерген-специфической иммунотерапии. У разных исследователей отличается также пороговый уровень позитивности, который определяется по индексу стимуляции.

Под индексом стимуляции понимается отношение числа активированных базофилов в пробе с предполагаемым аллергеном к количеству активированных базофилов, в пробе с буферным раствором.

Специфичность и чувствительность теста

Метод проточной цитометрии позволяет отразить высокую чувствительность и специфичность при изучении влияния широкого спектра аллергенов: лекарственных, пищевых и др.

В таблице ниже представлены результаты чувствительности и специфичности активированных базофилов к разным аллергенам.

Вид аллергенаСпецифичностьЧувствительность
Белок молока9091
Белок пшеницы77,285
Рентгеноконтрастные вещества10062,5
β-лактамные антибиотики8055
Пыльца луговых трав10092,3

Контрольное исследование теста активации базофилов

Исследование проводилось с использованием специального набора Allergenicity kit в группе, состоящей из 350 детей с атопическим дерматитом.

Средний возраст детей, участвоваших в исследовании, составил от 2 до 3,5 лет.

У 240 детей наблюдалось течение заболевания средней тяжести, у 110 – тяжелое течение.

Уровень спонтанной активации базофилов у этих детей составлял 18,2, тогда как у здоровых детей этот показатель составляет 4,7.

Выяснилось, что активация базофилов  IgE-антителами у здоровых детей была значительно выше (79,1), чем у детей с атомическим дерматитом (29,1).

Чувствительность к белкам коровьего молока с использованием теста активации базофилов в исследовании составила 83%.

При повторном исследовании после проведения специальной диеты, исключающей аллергены, показал, что у 60-80% детей активация базофилов на аллергены исключенных продуктов, не выявляется.

Наибольшее снижение частоты выявления сенсибилизации при соблюдении диеты наблюдалось на аллергены следующих продуктов: говядины, круп рисовой и гречневой, коровьего молока, картофеля.

На рисунке ниже представлены показатели индекса активации базофилов на разные аллергены у детей с атомическим дерматитом и у условно здоровых детей.

Таким образом, тест активации базофилов методом проточной цитометрии является перспективным методов исследования гиперчувствительности немедленного типа.

Он рекомендуется в качестве компонента комплексной диагностики при выявлении пищевой и бытовой аллергии, а также в качестве теста-выбора при установлении лекарственной аллергии у пациентов в тяжелых случаях.

Материал проверен экспертами Актион Медицина

Источник: https://www.provrach.ru/article/3075-diagnostika-allergiy-metodom-protochnoy-tsitometrii

Принцип метода проточной цитометрии в клинической лабораторной диагностике – Статейный холдинг

Проточная цитометрия: преимущества метода и область применения

Количественная цитометрия – относительно новая методика микробиологического исследования дисперсионных сред, проводимая с помощью специального оборудования. Цитометрия бывает статической и проточной.

Статическая цитометрия проводится с использованием конфокальных микроскопов; при их отсутствии в ход идут слегка модифицированные люминесцентные микроскопы, оснащенные простыми и дешевыми системами анализа изображений.

Проточная цитометрия осуществляется на специальных аппаратах – сортерах и проточных цитрометрах.

Оба варианта количественной цитометрии имеют широчайшие возможности применения в практике медицинских и биологических исследований. Несмотря на разность используемого клинического материала и экспериментальных моделей решаемые ими задачи подчиняются общим принципам исследования.

Что такое проточная цитометрия?

Проточной цитометрией называют методику исследования дисперсионных субстанций в режиме поштучного анализа частиц, входящих в состав дисперсной фазы по сигналам, получаемым в ходе флуоресценции и рассеивания света.

Название методики точно отражает сущность обозначаемого процесса, состоящего в исследовании потока одиноких биологических частиц.

Методика проточной цитометрии была создана на базе специальных экспериментов по определению размера исследуемых частиц и подсчету их количества.

Первый клеточный сортер был создан в 1965 году, а с начала следующего десятилетия был налажен выпуск приборов, предназначенных для измерения интенсивности флуоресценции при нескольких длинах волн с целью определения сразу нескольких параметров изучаемых клеток.

Современные исследователи для осуществления проточной цитометрии используют приборы двух типов:

Устройство современных проточных цитометров настолько сложно и разнообразно, что с трудом поддается какому-либо обобщению и систематизации, однако несколько общих моментов, характерных для всех приборов, все же существует:

В ходе медицинских и биологических исследований изучаются образцы, приготовленные из клеток:

Принцип метода проточной цитометрии

Принципы, заложенные в основу процедуры цитометрии, чрезвычайно просты.

Суспензия, приготовленная из клеток, предварительно помеченных флуоресцирующими моноклональными антителами или флуорохромами, помещается в поток дисперсионной среды, пропускаемый через проточную ячейку.

Гидродинамическое фокусирование струи клеточной суспензии в струе дисперсионной среды приводит к тому, что исследуемые клетки или их ядра выстраиваются поодиночке и в таком порядке пересекают пучок сфокусированных световых (обычно лазерных) лучей.

Под воздействием определенных световых волн происходит одновременное возбуждение молекул разных флуоресцирующих красителей, что делает возможным анализ сразу нескольких параметров клеточных структур.

[attention type=red]
Свет, исходящий от флуорохромов, фокусируют при помощи оптической системы, состоящей из нескольких зеркал и линз, а затем раскладывают на определенные компоненты.
[/attention]

Полученные световые сигналы подвергают анализу и преобразованию в электрические импульсы, а затем – в определенные формы, приемлемые для компьютерной обработки и хранения полученной информации.

Флуорохромы

Для того чтобы облегчить процесс определения клеточных структур в ходе процедуры проточной цитометрии, используемую дисперсионную среду подкрашивают специальными флуоресцирующими красителями – флуорохромами.

После такой обработки исследуемые клетки приобретают способность флуоресцировать (светиться) под воздействием пучка световых лучей.

При выборе того или иного красителя пользуются целым рядом критериев:

Одним из самых востребованных флуорохромов является йодистый пропидий: его спектральные характеристики идеально подходят для выполнения проточной цитометрии.

Чтобы активизировать флуоресценцию, используя йодистый пропидий, исследователи прибегают к помощи обычного аргонового лазера (рабочая длина его волны составляет 480 нм). Площадь флуоресцирующего участка такова, что позволяет использовать вышеозначенный флуорохром для выполнения многопараметрических измерений.

Для проведения проточной цитометрии также используют:

В качестве флуорохромов могут использоваться также флуоресцирующие моноклональные антитела.

Вне зависимости от того, какой именно краситель принимает участие в процедуре, его количество должно быть прямо пропорционально содержанию ДНК в структуре клетки.

Чтобы добиться качественного прокрашивания всех клеточных структур, количество применяемого флуорохрома должно быть избыточным.

Большинство флуорохромов, вступающих в контакт с ДНК, не способно пройти сквозь мембраны неповрежденных (интактных) клеток. Для повышения проницаемости клеточных мембран исследуемые клетки обрабатывают поверхностно-активными веществами (детергентами) или спиртом.

Преимущества

Несомненными преимуществами проточной цитометрии можно считать:

Где применяется?

Спектр применения проточной цитометрии необыкновенно широк. Она применяется даже в индустрии, для контроля производственного процесса. Продемонстрируем это, для наглядности представив информацию в виде списков.

В онкологии

В этом разделе медицины проточную цитометрию применяют с целью:

о методе проточной цитометрии в диагностике острых лейкозов:

Иммунологии

Метод проточной цитометрии позволяет:

Цитологии

Проточная цитометрия дает исчерпывающие данные, позволяющие:

Гематологии

С помощью проточной цитометрии гематологи могут:

Фармакологии

Проточная цитометрия помогает фармакологам:

Сельском хозяйстве

Метод проточной цитометрии активно используется учеными, специализирующимися на селекции новых видов растений и выведении пород домашнего скота, поскольку она позволяет:

Сохрани статью себе в соцсеть!

Источник: https://teora-holding.ru/printsip-metoda-protochnoj-tsitometrii-v-klinicheskoj-laboratornoj-diagnostike/

Поделиться:
Нет комментариев

    Добавить комментарий

    Ваш e-mail не будет опубликован. Все поля обязательны для заполнения.